Edição gênica em células de bovinos para inserção de genes de interesse no Locus H11 do genoma bovino

Ana Carolina Vieira da Silva, Jéssica Müller, Antonioni Guedes Fidelis, Eduardo de Oliveira Melo

Resumo


A pecuária bovina tem grande influência nas exportações brasileiras e consequentemente na economia do país. As doenças infecciosas e parasitárias se tornam grandes impedimentos para o crescimento da atividade, uma vez que afetam significativamente a produtividade dos animais. Com o desenvolvimento de novas biotecnologias, é possível a aplicação de técnicas para obtenção de animais geneticamente modificados, uma vez que a transgenia animal é uma ferramenta relevante para a obtenção de animais mais resistentes a fatores abióticos e bióticos. Dentre as técnicas mais atuais de edição e modificação de genes podemos citar a CRISPR/Cas9. A técnica de CRISPR foi descoberta através de uma análise de como o sistema imunológico da bactéria funciona contra vírus, que insere seu material genético no genoma da bactéria e serve de molde para o gRNA, que se une com a Cas9 e procura uma sequência complementar no genoma de outro vírus infectante para gerar uma quebra na fita, podendo resultar em inserções ou deleções de genes. Para a realização da técnica de CRISPR/Cas9, é necessário um fluxo de trabalho para triagem, composto por etapas fundamentais: construção e sequenciamento dos vetores, produção dos guias para Cas9 e dos primers; transformação do vetor; transfecção de células; amplificação por PCR e ensaios de digestão com enzima endonuclease T7E1 para avaliar a edição genômica realizada. No laboratório ela pode ser usada através de transfecção celular, um método que possibilita o transporte de genes exógenos para dentro das células de interesse, para isso o ensaio de digestão com a enzima T7Endonuclease1 (T7E1) é utilizada, já que reconhece e corta as regiões do DNA que não foram pareadas de forma correta na etapa anterior (PCR), possibilitando identificar as regiões que tiveram sucesso na indução de edição nos genes alvos. O objetivo da pesquisa foi investigar a aplicação do sistema CRISPR/Cas para edição genômica e estabelecer a metodologia mais eficiente para inserir o gene de interesse em um local específico e seguro do genoma denominado locus H11, para que futuramente seja possível produzir embriões bovinos transgênicos. Este trabalho demonstrou que os testes e análises para padronização dos procedimentos e a escolha dos melhores parâmetros são extremamente importantes. Os resultados mostram que é importante saber a origem da célula transfectada, já que cúmulus apresentou bandas fantasmas e impossibilitou a análise de edição. Quanto a transfecção, o melhor reagente foi o Xfect armazenado no congelador que apesar de não apresentar uma mortalidade celular ideal. Além disso, ficou comprovado também a importância de um controle positivo da enzima T7E1 e do controle negativo com DNA de células não transfectadas no ensaio de digestão. A confirmação da expressão heteróloga de genes de interesse e da edição genômica não foi possível até o momento, mas pode-se concluir que a técnica de CRISPR é uma ferramenta de fácil execução e relativamente rápida, e com os melhores parâmetros definidos, valida a abordagem para experimentos futuros.


Palavras-chave


CRISPR; transfecção; edição genômica; animais transgênicos; bovinos.

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DOI: https://doi.org/10.5102/pic.n0.2020.8277

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